A sejtmembrán tulajdonságainak megismerésére irányuló vizsgálatok elsősorban a membránoknak a sejfolyamatokban betöltött nagy fontossága miatt központi helyet foglalnak el a sejtbiológiában és a molekuláris biológiában. A kapott eredmények azonban annak megértéséhez is közelebb visznek, hogy milyen változások vezetnek abnormális sejtek (beleértve a rákos sejteket) kialakulásához, valamint ahhoz, hogy a különféle gyógyszerek milyen hatásmechanizmus alapján működnek.

A sejtmembrán lipid kettősrétegében mozaikszerűen elhelyezkedő fehérje molekulák, esetenként oligoszacharidokkal glikoproteineket képeznek és speciális funkciót látnak el (pl. antigének, receptorok, ioncsatornák stb.). A hormonok, interferonok, interleukinok, stb. általában nem lépnek be a sejt belsejébe, amelyre hatásukat kifejtik, hanem a sejtmembránban elhelyezkedő specifikus receptorokhoz való kötődés után, jelátvivő folyamatokon keresztül közlik információjukat a sejttel. A biológiai kommunikációnak ez a formája első lépésként membránszinten indul, a folyamatot elindító molekula (elsődleges hírvivő) a megfelelő receptoron keresztül továbbítja az információt a másodlagos hírvivőhöz (messengerhez), amely biokémiai folyamatok láncolatát indítja el a sejtben. A jelátvivő folyamat során megváltozhat a sejtmembrán permeabilitása, eltolódhatnak az intracelluláris ionkoncentrációk, változhat a membránfehérjék kölcsönhatása, egymáshoz képesti elhelyezkedése, a membrán dinamikus tulajdonságai miatt. Ezek a változások jól nyomonkövethetők egy sor biokémiai, fiziko-kémiai módszerrel. Mivel a membránváltozások igen gyorsak, így a nagy időfeloldóképességgel bíró spektroszkópiai módszerek, mint pl. a fluoreszcencia és az ESR spektroszkópia fontos vizsgálati módszerei a területnek. Ezek a módszerek különféle specifikus jelzők membránba való beépítését igénylik. Előállítottak olyan jelzőket, amelyek mesterséges lipidekhez kötötten beépűlnek a membránba, vagy specifikusan kötődnek a receptorokhoz anélkül hogy a vizsgált membránfolyamatokat megváltoztatnák.

Alkalmazott módszerek

Humán sejteken végzett vizsgálataink során az alábbi spektroszkópiai méréseket végeztük el:

1. Fluoreszkáló jelző molekulák segítségével ismeretek szerezhetők a membránok felépítéséről, tulajdonságairól és azok megváltozásairól, beleértve a membrán fluiditását, elektromos tulajdonságait, speciális membránkomponensek elhelyezkedését és mozgását, valamint konformációs változásait.

1.a. Áramlási citométer segítségével, megfelelő fluoreszkáló jelzők alkalmazásával 1 nagyszámú sejt gyors vizsgálata végezhető el. A teljesség igénye nélkül az alábbi igen fontos membránjellemzők mérhetők, zárójelben példaként megadjuk az alkalmazott fluoreszkáló jelző festékeket: a sejfelszíni antigének kifejeződésének mértéke (FITC), a sejtciklus (propidium-jodid), a membránpotenciál (feszültségérzékeny festék pl. oxonol), a Ca²⁺-ionkoncentráció változása (Fluo3), stb.

1.b. Fluoreszcencia polarizációs módszerrel, difenil-dexatrién (DPH) jelző festék alkalmazásával meghatározható a lipidek mozgása és orientációja, a membrán mikroviszkozitása. A lumineszcencia polarizációs fokának méréséből kiegészítve további lumineszcencia jellemzők (fluoreszcencia szinkép, hatásfok stb.) meghatározásával a molekulaszerkezetről, a membránalkotók közötti gerjesztési energia vándorlásáról és a küzöttük levő távolságokról kaphatunk fontos információt.

2. Egyedi sejteken lézermikroszkóp segítségével FRAP 2 (Fluorescence Recovery After Photobleaching) módszerrel végezhetők vizsgálatok. Meghatároztározható a membránok fehérje és lipid komponenseinek laterális diffúziós állandója, a sejtek közötti kommunikáció, a sejt pH-ja, stb.

3. ESR spektroszkópiai mérésekkel nitroxil és maleimid spinjelzők alkalmazásával 3 a membrán fluiditásáról információt adó S rendezettségi paraméter határoztó meg.

Az elvégzett vizsgálatok

Mint ismeretes az interferonok (IFN-, , ) sejtek által vírusfertőzés hatására szintetizált fehérjék, vírusellenes, sejtosztódást gátló, immunrendszert befolyásoló tulajdonságokkal, amelyek a szervezet védekező rendszere szempontjából igen fontosak, továbbá bizonyos rosszindulatú daganatos megbetegedések, leukémiák, vírusfertőzések (pl. hepatitis C) esetén gyógyszerként is alkalmazzák.

Az ismertetett spektroszkópiai módszereket az -IFN (leukocita interferon) sejtosztódást gátló hatásának kialakulásához vezető jelátviteli mechanizmus korai lépéseinek tanulmányozásához használtuk fel. A vizsgálatokat sejtszuszpenzióban nevelt Burkitt limfómából származó Daudi sejtek interferon szenzitivitásban lényegesen különböző klónjain és U937 monocita sejteken végeztük.

A sejtmembrán dinamikai és elektromos tulajdonságainak mérésével a szerkezet és funkció kapcsolatáról kaptunk információt. Vizsgálataink megerősítették, hogy az áramlási citometriás, FRAP és ESR módszerek alkalmasak élősejteken történő a membránban bekövetkező változások vizsgálatára. Kimutattuk továbbá, hogy az interferon jelátvitel során megváltoznak a sejtmembrán dinamikai tulajdonságai, valamint a membránon keresztüli K⁺ ionfluxus. Az eredmények közelebb visznek különféle gyógyszerek hatásmechanizmusának felderítéséhez is. Vizsgálhatjuk továbbá in vitro körülmények között a terápiák során alkalmazott gyógyszerkombinációk együttes hatását is, mint pl. az -IFN-nal együtt alkalmazott tamoxifen vagy trental okozta membránváltozásokat.

Hivatkozások

[1] Z. Krasznai, T. Márián, L. Balkay, M. Emri, L. Trón: J. Photochem. Photobiol. 28, 93,(1995).

[2] H.M. Shapiro: Cytometry, 1, 301, (1981).

[3] E. Balint, H. Fang, Y. Gan, A. Aszalos, P.M. Grimley: J. Interferon and Cytokine Research 15, 113, (1995).