A világ lakosságának egyharmada fertõzött Mycobacterium tuberculosis-sal, amely az egyik legelterjedtebb fertõzõ betegséget, a tuberkulózist okozza. A szenzitizáltság (fertõzés vagy korábbi BCG vakcináció) kimutatására tisztított tuberkuloproteinnel (különbözõ fehérjékbõl álló keverék) végzett bortesztet alkalmaznak, amely nem tesz különbséget latens fertõzöttség, betegség, illetve BCG vakcináció között. A környezeti mycobacteriumok által okozott fertõzés fals pozitív eredményhez vezethet, míg HIV fertõzött vagy súlyosan beteg egyének fals negatív eredményt adnak. Ezért szükségessé vált egy új immundiagnosztikum kifejlesztése, amely lehetõvé teszi a szenzitizáltság specifikus és érzékeny detektálását. Ilyen immundiagnosztikum lehetne egy molekulárisan jól jellemzett antigén preparátum, amelyet szintetikus peptidek vagy elágazó láncú szintetikus polipeptid-peptid konjugátumok alkotnak.

Az M. tuberculosisból származó 38 és 16 kDa fehérjék specifikus T sejtes immunválaszt váltanak ki. Korábbi kísérletek [Vordermeier et al. Intl. Immunol., 7, 559, 1995; Friscia et al. Clin Exp Immunol, 102, 53, 1995] alapján három, egér és humán T sejtes immunválaszt kiváltó peptidet választottunk ki további vizsgálatok céljából: ⁶⁵FNLWGPAFHERYPNVTITA⁸³ a 38 kDa fehérjébol, ²¹LFAAFPSFAGLRPTFDTRLM⁴⁰ és ⁹¹SEFAYGSFVRTVSLPVGADE¹¹⁰ a 16 kDa fehérjébõl.

Célkitûzéseim a következõk voltak: 1) minimális hosszúságú T sejt epitopok lokalizálása a három kiválasztott régión belül; 2) azon minimális hosszúságú, T sejt epitopként mûködõ peptidek meghatározása, amelyek tartalmazzák az elõzõ pontban lokalizált epitop régiót; 3) a flank-régiók (a minimális hosszúságú T sejt epitopok N/C terminális aminosavai) szerepének a tisztázása; 4) a T sejt stimuláló hatás módosítása szintetikus, elágazó láncú polipeptidekhez való kovalens kapcsolás által. A vizsgálatok távlati célja peptid-immundiagnosztikum kifejlesztése a tuberkulózis diagnosztizálására. E cél megvalósítása érdekében elsõ lépés a specifikus és funkcionális T sejt epitopok lokalizálása a kiválasztott fehérjéken belül. Ezen adatok birtokában lehetõvé válik olyan szintetikus származékok tervezése és készítése, amelyek megnövekedett immnustimuláló hatással rendelkeznek.

A T sejt epitopok lokalizálására a PEPSCAN módszert használtam 15 aminosavas, egymással 14 aminosavanként átlapoló peptidek segítségével, amelyek befedték az 51-97 szakaszt a 38 kDa-os fehérjébõl, illetve a 7-54 és 78-124 szakaszokat a 16 kDa-os fehérjébol. A proliferációs kísérleteket egér T sejt hibridómák és perifériás humán vérbõl származó T sejtekkel végeztem. A kapott eredmények alapján 45 C-terminális amid peptidet szintetizáltam szilárd fázisú peptidszintézissel. A nyers peptideket félpreparatív RP-HPLC módszerrel tisztítottam, a tisztított peptidek homogenitását analitikai RP-HPLC-vel vizsgáltam. A termékekek elsodleges szerkezetét aminosavanalízissel és tömegspektrometriával ellenõriztük. Az oldott peptidek másodlagos szerkezetét CD spektroszkópiával vizsgáltuk vizes (PBS), 2,2,2-trifluoretanolos (TFE) oldatban, vagy PBS:TFE=1:1 (vol/vol) arányú keverékében. A konjugált peptidek készítése céljából elõállítottam a poli[Lys-(Glui-DL-Alam)] (EAK), poli[Lys-(Suc-Glui-DL-Alam)] (SucEAK), poli[Lys-(Ac-Glui-DL-Alam)] (AcEAK) ) szintetikus, elágazó láncú polipeptideket, amelyek segítségével 27 konjugátumot készítettem. EAK-ból kiindulva két különbözõ peptidet tartalmazó konjugátumokat is készítettem, egy amid és egy diszulfid kötés kialakításával. A konjugátumok heterogenitását RP-HPLC-vel, összetételüket aminosavanalízissel határoztuk meg. A szintetikus peptidek és konjugátumaik T sejt választ kiváltó képességét peptid-specifikus egér hibridómák, immunizált egerek nyirokcsomóiból és perifériás humán vérbõl származó T sejtek proliferációjával, valamint a termelt IFN-? mérésével vizsgáltam. A konjugátumok processzálásának szükségességét proliferációs kísérletekben ellenõriztem, fixált antigén prezentáló sejtek jelenlétében. Izolált, egér MHC II (I-A^d) glikoproteinekhez való kötõdési vizsgálatokat is végeztem a T sejt válasz mechanizmusának tisztázása céljából.

Eredmények és következtetések:

1. Az átlapoló szintetikus peptidek segítségével meghatározott minimális hosszúságú egér T sejt epitop a 16 kDa fehérje 21-40 és 91-110 régióin belül a ²³AAFPSF²⁸ (21-40) és ⁹⁵YGSFVRT¹⁰¹ (91-110) peptidek voltak. Ugyanígy a humán T sejt epitop a 38 kDa fehérje 65-83 szakaszán belül a ⁷³HERYPNVTIT⁸².

2. Az ilymódon meghatározott, minimális hosszúságú T sejt epitopok nem funkcionálisak egér T sejt hibridóma, egér nyirokcsomósejtek és perifériás humán vérbõl származó T sejtek proliferációja alapján.

3. A dedukált epitopok alapján peptideket terveztem és szintetizáltam, amelyek segítségével meghatároztam a funkcionális T sejt epitopot a három kiválasztott régión belül: ²¹LFAAFPSFAGL³¹ (21-40, 16 kDa), ⁹³FAYGSFVRTV¹⁰² (91-110, 16 kDa), és ⁷³HERYPNVTI⁸¹ (65-83, 38 kDa).

4. Azonosítottam két kulcsfontosságú aminosavat a ⁷³HERYPNVTI⁸¹ epitopon belül (N⁷⁸, I⁸¹), amelyek elengedhetetlenek a T sejtes immunválasz kiváltása és a rendezett oldatbeli konformáció felvétele céljából.

5. Bebizonyítottam, hogy a flank régióknak fontos szerepe van a biológiai hatás növelésében és az oldatbeli, másodlagos szerkezet kialakulásában.

6. Nem-natív flank aminosavak (Ala, Ser) ugyanolyan hatásosnak (olykor hatásosabbnak) bizonyultak a T sejtes immunválasz növelésében, mint a natív régiók.

7. Dokumentáltam, hogy az epitop-specifikus immunválasz megmarad vagy növekszik a flank régiók megfelelõ manipulálása, tervezése segítségével.

8. Bebizonyítottam, hogy az epitop-specifikus immunválasz manipulálható a peptid szintetikus, elágazó láncú polipeptidhez való konjugálása által: a peptid epitop-specifikus hatása megmarad vagy növekszik a konjugálás hatására.

A kísérleteket az MTA Peptidkémiai Kutatócsoportban (Eötvös Loránd Tudományegyetem, Budapest) és a Tuberculosis and Related Infections Unit (Royal Postgraduate Medical School, London) laboratóriumban végeztem a WHO támogatásával (Grant T/9181/133). Ezúton szeretném megköszönni témavezetõm Dr. Hudecz Ferenc áldozatkész segítségét, amely végigkísérte a munkámat. Köszönettel tartozom Prof. Juraj Ivanyi-nak, hogy londoni laboratóriumában támogatta munkám elvégzését.
 

* A kísérleti munka az MTA Peptidkémiai Kutatócsoportjában készült. Eötvös Loránd Tudományegyetem 1117. Budapest, Pázmány sétány 1/a.
 

1. Introduction and objectives

Tuberculosis is one of the leading causes of death due to a single infectious agent. One third of the world’s population, are estimated to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Infection or previous BCG vaccination is determined by skin reactivity to purified protein derivative (PPD), a mixture of proteins released from growing cultures of M. tuberculosis. The skin reaction is a marker of sensitisation, not disease. False positive reactions can arise in individuals infected with environmental mycobacteria, and false negative reactions are shown by individuals coinfected with HIV or by severely ill patients. It is therefore necessary to develop new tools for the immunodiagnosis of tuberculosis. One possibility is to replace PPD with an antigen preparation, which is molecularly well characterised, sensitive and differentiates between infection with M. tuberculosis and other mycobacteria, and/or between infection and disease. This preparation could be composed of synthetic peptides in conjunction with new synthetic delivery/adjuvant systems.

The 16 kDa and 38 kDa proteins of M. tuberculosis trigger specific immune responses, they are therefore logical targets for the development of subunit reagents for immunodiagnosis. A prominent T cell stimulatory domain of the 38 kDa protein was previously located in region 65-83 [Vordermeier, H. M. et al. Intl. Immunol., 7, 559, 1995]. T cell stimulatory peptides (21-40 and 71-90) within the 16kDa protein were localised using 14 overlapping 20-mer peptides (spanning the entire sequence), and murine lymph node and spleen cells [Vordermeier, H. M.et al. Immunology, 80, 6, 1993]. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from PPD positive controls and patients with active tuberculosis responded with the highest frequency to peptide 91-110, which was recognised by 67% of controls and 50% of tuberculosis patients [Friscia, G. et al. Clin Exp
Immunol, 102, 53, 1995]. Based on these findings
I selected three regions for detailed analysis: ⁶⁵FNLWGPAFHERYPNVTITA⁸³ from the 38 kDa protein, ²¹LFAAFPSFAGLRPTFDTRLM⁴⁰ and

⁹¹SEFAYGSFVRTVSLPVGADE¹¹⁰ from the 16 kDa protein. The objectives of the present project were the following: 1) to localise the T cell epitope cores within the selected regions; 2) to determine the minimal size of the peptides containing the epitope core, and functioning as T cell epitopes; 3) to clarify the role of the flanking regions (amino acids on the N- and C- terminal of the epitope core); 4) to modify the T cell stimulatory activity of peptides by covalent attachment to synthetic macromolecular polypeptides. The long term aim of this research project is to develop a peptide based diagnostic reagent for the improved immunodiagnosis of tuberculosis. Localisation of specific, functional T cell epitopes within mycobacterial proteins is the first important step. Based on such data it might be possible to design and prepare synthetic derivatives of potentially enhanced stimulatory capacity.
 

2. Methods

In order to localise the T cell epitope core within the selected regions, PEPSCAN analysis was performed using 15-mer peptide amides overlapping by 14 amino acids, and covering the sequence of residues 51-97 from the 38 kDa protein, 7-54 and 78-124 from the 16 kDa protein (purchased from Cambridge Research Biochemicals, Norwich, UK). The proliferation assays were conducted using hybridoma T cells or human peripheral blood mononuclear cells. On the basis of the results obtained, 45 peptide amides (corresponding to the selected regions) were synthesised by solid phase peptide synthesis (using Fmoc or Boc methodology), purified and verified by RP-HPLC, analysed by amino acid analysis and mass spectrometry. The secondary structure of peptides in solution was investigated by circular dichroism spectroscopy in aqueous solution (PBS), 2,2,2-trifluoroethanol (TFE) and in a 1:1 PBS:TFE mixture (vol/vol). In order to prepare conjugated peptides, synthetic branched polypeptide poly[Lys-(Glui-DL-Alam)] (EAK) was produced. The amino group of the side chain terminating Glu was either succinylated leading to poly[Lys-(Suc-Glui-DL-Alam)] (SucEAK), or acetylated obtaining poly[Lys-(Ac-Glui-DL-Alam)] (AcEAK).27 peptides were conjugated to AcEAK or SucEAK by introducing an amide bond between the ?-carboxyl group of the Glu in the polypeptide and the N-terminal of the peptide. Conjugates containing two different peptide epitopes were also prepared by the formation of an amide and a disulphide bond between EAK polypeptide and the two peptides. The heterogeneity of the conjugated compounds was analysed by RP-HPLC and their composition was determined by amino acid analysis. The T cell stimulatory capacity of synthetic peptides and conjugates was explored by detecting proliferation of peptide-specific murine T cell hybridomas, LN cells from immunised mice, and peripheral blood mononuclear cells from PPD positive individuals, and by measuring the amount of IFN-? produced. The necessity for processing of conjugated peptides was tested in proliferation experiments using fixed antigen presenting cells (APC). Solid phase binding assays using isolated mouse class II MHC glycoproteins (I-A^d) were also performed in order to elucidate the mechanism of the T cell response.
 

3. Results

Analysis of 65-83 domain of the 38 kDa protein

The human T cell epitope core was localised by PEPSCAN analysis between residues ⁷³HERYPNVTIT⁸², which contained the previously deduced murine T cell epitope core 75-81. In proliferation assays using T cell hybridomas, lymph node cells from mice or human PBMC, the peptide representing the deduced murine T cell epitope core ⁷⁵RYPNVTI⁸¹ elongated with one amino acid at the N-terminal from the native sequence (⁷⁴ERYPNVTI⁸¹) did not induce a T cell response. Further extending 75-81 with native flanking regions, peptide ⁷³HERYPNVTI⁸¹ functioned as a T cell epitope. Elongation of the non-functional sequence 75-81 with non-native flanking residues resulted in peptide A2SA-75-81-A4, which induced strong proliferation of T cells from mice immunised with the native peptide 65-83. Peptide ⁷³HERYPNVTI⁸¹ itself was not immunogenic in mice, but induced strong proliferative response in ⁷²FHERYPNVTI⁸¹ immunised mice. Peptides ⁷²FHERYPNVTI⁸¹ and A2SA-75-81-A4 (containing only the deduced core from the native sequence and non-native flanks) were more immunogenic than the native peptide 65-83. These findings indicate that non-native flanking regions can enhance the T cell stimulatory capacity of the deduced T cell epitope core, and can also markedly increase the peptide’s immunogenicity.

In the case of conjugated peptides, preservation or modification of the epitope specific T cell response was observed. Peptide ⁷⁴ERYPNVTI⁸¹, unable to induce proliferation or IFN-? production, showed highly increased activity after conjugation with synthetic branched polypeptides. Peptides ⁷³HERYPNVTITA⁸³ or ASA-75-81-A4 preserved their T cell stimulatory capacity when conjugated. The unconjugated polymeric polypeptides were not stimulatory.
 

Analysis of 21-40 domain of the 16 kDa protein

The murine T cell epitope core deduced by PEPSCAN analysis was ²³AAFPSF²⁸. This peptide did not stimulate the proliferation of mouse LN cells or human PBMCs, indicating that the core is not functional. Elongating ²³AAFPSF²⁸ with native flanking regions (²¹LFAAFPSFAG³⁰) did not result in T cell stimulatory peptide. The smallest functional T cell stimulatory peptide was found to be ²¹LFAAFPSFAGL³¹ elongated with non-native flanks: SA2-21-31-A. Conjugation to branched polypeptides increased the T cell stimulatory capacity of peptides which were not (like ²¹LFAAFPSFAGL³¹), and peptides which were, able (like SA-21-30-A) to provoke proliferation.
 

Analysis of 91-110 domain of the 16 kDa protein

The PEPSCAN analysis revealed the murine T cell epitope core to be ⁹⁵YGSFVRT¹⁰¹ for two T cell hybridoma clones, or the longer sequence ⁹⁴AYGSFVRTV¹⁰² for a third clone. Peptide ⁹⁵YGSFVRT¹⁰¹ elongated by one amino acid from the native sequence (⁹⁴AYGSFVRT¹⁰¹) was not stimulatory. Further elongation with native amino acids at both N- and C- terminals resulted in peptide ⁹³FAYGSFVRTV¹⁰² which was able to induce hybridoma T cell proliferation. This peptide therefore can be considered as a functional T cell epitope. Elongating the functional T cell epitope ⁹³FAYGSFVRTV¹⁰² with A- and -AA at the N- and C-terminals, peptide AFAYGSFVRTVAA proved
to be a more efficient immunogen than peptide ⁹¹SEFAYGSFVRTVSLPVGADE¹¹⁰, the native sequence. The T cell stimulatory capacity of the non-functional murine T cell epitope core was not increased by conjugation, while the activity of peptide 91-110 was preserved in its conjugated form.
 

Mechanism of the T cell response

Processing of AcEAK conjugated peptide 65-83 and a conjugate bearing two peptide epitopes (91-110 and 65-83) was investigated using a murine T cell hybridoma and fixed APCs. These experiments showed that the conjugated peptides, like the 38 kDa protein itself, need to be taken up and processed by antigen presenting cells for T cell stimulation. MHC class II binding experiments revealed strong binding of the deduced murine (I-A^b) T cell epitope cores, with the highest binding affinity for peptides ²³AAFPSF²⁸ and ²¹LFAAFPSFAG³⁰ from the 21-40 region, and ⁹⁴AYGSFVRT¹⁰¹ and ⁹³FAYGSFVRTV¹⁰² from the 91-110 region of 16 kDa protein.
 

4. Conclusions

1. Using overlapping synthetic peptides, the minimal size murine T cell epitope cores were deduced as ²³AAFPSF²⁸ (in 21-40) and ⁹⁵YGSFVRT¹⁰¹ (in 91-110) from the 16 kDa protein, and the human T cell epitope core ⁷³HERYPNVTIT⁸² (within 65-83) from the 38 kDa protein.

2. Evidence was provided that such minimal peptides do not function as T cell epitopes in proliferation assays using hybridomas, LN cells from mice or human PBMCs.

3. Using synthetic peptides containing the deduced minimal core, elongated with native flanking regions, the minimal size peptides functioning as murine T cell epitopes were identified: ²¹LFAAFPSFAGL³¹ (within region 21-40), ⁹³FAYGSFVRTV¹⁰² (region 91-110), and ⁷³HERYPNVTI⁸¹ (region 65-83).

4. Two key residues (N⁷⁸, I⁸¹) were identified in 73-81 epitope (38 kDa protein), which were necessary for the T cell stimulatory function of the peptides, and also for adopting an ordered conformation in solution.

5. I have demonstrated that flanking regions can increase the biological activity and alter the secondary structure of the peptides in solution.

6. Non-native flanking amino acids (Ala, Ser) proved to be equally or more efficient in enhancing T cell stimulatory activity of the deduced core, than native flanks.

7. I have documented that the epitope specific immune response can be maintained or even increased by careful design of the flanking regions.

8. I have demonstrated that it is feasible to manipulate the epitope specific immune response by covalent attachment of epitopic peptides to synthetic branched polypeptides: the epitope specific immune response of the peptides is preserved, or even enhanced by their conjugation to polymeric polypeptides.
 

Publications related to the PhD thesis

1. M.V. Pimm, S.J. Gribben, K. Bogdán and F. Hudecz: The effect of charge on the biodistribution in mice of branched polypeptides with a poly(L-lysine) backbone labelled with ¹²⁵I, ¹¹¹In or ⁵¹Cr, J. of Controlled Release 37, 161-172, 1995.

2. D.P. Harris, H.M. Vordermeier, A. Arya, K. Bogdán, C. Moreno, J. Ivanyi: Immunogenicity of peptides for B cells is not impaired by overlapping T cell epitope topology, Immunology 88, 348-354, 1996.

3. M. Idei, G. Dibó, K. Bogdán, G. Mezö, A. Horváth, J. Érchegyi, Gy. Mészáros, I. Teplán, Gy. Kéri, F. Hudecz: Analysis of macromolecular branched chain polypeptides by capillary electrophoresis and micellar electrokinetic chromatography, Electrophoresis 17, 1357-1360, 1996.

4. K. Bogdán, H.M. Vordermeier, J. Kajtár, M. Mák, J. Ivanyi, F. Hudecz: Influence of peptide length, nature of flanking sequences and fidelity of critical residues on T cell recognition of an immunodominant epitope from the M. tuberculosis 38 kDa protein, in Peptides in Immunology, Ed. C. H. Schneider, 85-92, 1996.

5. K. Bogdán, H.M. Vordermeier, S. Jurcevic, J. Ivanyi, F. Hudecz: Analysis of the antigenic structure of two immunodominant regions of the 16 kDa protein of M. tuberculosis: elucidation of the minimal size T cell epitopes. In: Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis - Peptides, Polypeptides and Oligonucleotides - 1995. Ed. R. Epton, Mayflower Worldwide, Birmingham, UK, p. 329 (1996)

6. Wilkinson, K.A., Vordermeier, M.H., Kajtar, J., Jurcevic, S., Wilkinson, R.J., Ivanyi, J., Hudecz, F.: Modulation of peptide specific T cell responses by non-native flanking regions, Molecular Immunology 34: 1237-1246 (1997)

7. Bogdán, K.,Vordermeier, H.M., Ivanyi, J., Hudecz, F.: Modulation of T cell specific immune responses against the 16 kDa protein of M. tuberculosis by alteration of flanks or conjugation to synthetic branched polypeptide carrier. In: Peptides 1996. Proc. 24th European Peptide Symposium, Ed. R. Ramage, Mayflower Scientific Ltd. p.115-118 (1998)

8. Wilkinson, K.A., Vordermeier, H.M., Wilkinson, R.J., Ivanyi, J., Hudecz, F. Synthesis and in vitro T-cell immunogenicty of conjugates with dual specificity: attachment of epitope peptides of 16kDa and 38 kDa proteins from M. tuberculosis to branched polypeptide. Bioconjugate Chemistry 9(5): 539-547 (1998)

9. Hudecz, F., Wilkinson, K.A., Vordermeier, H.M., Kajtar, J., Jurcevici, S., Wilkinson, R.J., and Ivanyi, J. Design of synthetic antigen containing non-immunogenic T cell epitope core and simple non-native flanking regions. In: Peptide Science- Present and Future, Proceedings of the 1st International Peptide Symposium, Y. Shimonishi (ed), 1999, p: 820-822.

10. Venkataprasad N., Coombes, A.G.A., Singh, M., Rohde, M., Wilkinson, K.A., Hudecz, F., Davis, S.S., Vordermeier, H.M.: Induction of cellular immunity to mycobacterial antigen adsorbed on lamellar particles of lactide polymers. Vaccine (1999) 17: 1814-1819.

11. Wilkinson, K.A., Hudecz, F., Vordermeier, H.M., Ivanyi, J., Wilkinson, R.J.: Enhancement of the T cell response to a mycobacterial peptide by conjugation to synthetic branched polypeptide. European Journal of Immunology (1999) 29: 2788-2796.

* The experiments were carried out in, Research Group for Peptide Chemistry, Hungarian Academy of Sciences, Eötvös Loránd UniversityPázmány sétány 1/a H-1117 Budapest, Hungary.