Berthelot pályáját Antoine-Jérome Balard munkatársaként kezdte a párizsi Collège de France-ban (1851). Doktori értekezése révén vált ismertté; Michel-Eugène Chevreul glicerinnel foglalkozó munkáját ebben folytatta és bővítette ki. A párizsi École Supérieure de Pharmacie szerveskémia professzora (1859) lett, majd elvállalta a Collège de France-ben számára létrehozott szerveskémiai tanszék vezetését (1865). A felsőoktatás felügyelőjeként (1876) tevékeny részt vállalt oktatási kérdések megoldásában. 1881-ben örökös szenátorrá választották. A közoktatási miniszteri (1886-87) és külügyminiszteri (1895-96) poszton is működött.
Berthelot fontos kutatásokat végzett az alkoholok és karbonsavak körében, a szénhidrogének (egyebek között az acetilén) szintézisében és a reakciósebesség vizsgálatában. A robbanóanyagokkal végzett munkája eredményeként felfedezte a nyomáshullámot. Kétségbe vonta azt az általánosan elfogadott állítást, hogy a szerves vegyületek életfolyamatok közreműködésével képződhetnek. Véleménye szerint a kémiai folyamatok nem sajátos, csak rájuk jellemző törvények szerint mennek végbe, hanem értelmezhetők a mechanikának a világegyetemben mindenütt érvényes törvényei szerint. Bevezette az exoterm és endoterm reakciók fogalmát és újra felfedezte a baktériumok szerepét a talaj nitrogén-megkötésében. Az alkímia és a kémia történetéről szóló írásai a maguk területén klasszikus művek.
Berthelot kb. 1600 könyvet és cikket publikált a kémia különböző ágaiban. Alkímiai és kémiai műveket fordított le görög, szír és arab nyelvről. Sok cikket írt a La Grande Encyclopédie-be, melynek a megalapítója volt. Munkásságának végső szakaszát a mezőgazdasági kémiának, valamint történelmi írásainak szentelte. 1889-ben követte Louis Pasteurt a párizsi Tudományos Akadémia titkári székében.