Mucsi Zoltán Szerinproteáz-inhibitorok: a szintetikus modellezéstôl az ab initio számításokig
A bioorganikus kémia fontos kutatási területe az enzimek mûködésének megismerése, ide értve az enzimmûködés gátlását és aktiválását is. Ehhez csatlakozóan a peptidkémia egyik legdinamikusabban fejlôdô ága a biológiailag aktív peptidek izolálása, szintézise és a szerkezet-hatás összefüggések felderítése. Manapság a számítógépek teljesítménye már megengedi, hogy komplex, biológiai rendszerek mûködését – fôként ezek egyszerûsített modelljein keresztül – értelmezni tudjuk, attól azonban még távol vagyunk, hogy a szintetizált modellvegyületeket és a logikus laboratóriumi kísérleteket mell?zhessük. Az említett három tudományterület összekapcsolása útján az ELTE Szerves Kémiai Tanszékén egy viszonylag kis molekulájú, 35 aminosavrészbôl álló kimotripszin-inhibitor (Schistocera Gregoria Chymotrypsin Inhibitor, SGCI) modellezésével foglalkoztunk, amelyet 1998-ban Gráf László és munkatársai izoláltak a sivatagi sáskából. Az elsôdleges szerkezet meghatározása után az inhibíciós tulajdonságokat Patthy András tanulmányozta. Az SGCI a kanonikus inhibitorok családjába tartozik, azaz a peptid aktív centrumát alkotó aminosavak, azaz a P1-P1’ pozíció, amit kötôhuroknak is hívnak, tökéletesen megegyezik egy közönséges kimotripszin-szubsztrát aminosav-sorrendjével. Ugyanakkor egy kimotripszin-szubsztrát és egy kanonikus inhibitor viselkedése között hatalmas különbség van, hiszen a szubsztrátot az enzim pillanatok alatt elhasítja, míg az inhibitor csak hetek alatt hasad el. E kettôsségre a válasz feltehetôen az inhibitormolekula 3D- szerkezetében, azaz konformációjában kereshetô. Gáspári Zoltán és Perczel András (1999) sikeresen meghatározták az SGCI-peptid térszerkezetét, amelyet három antiparallel ?-redô stabilizál és tesz igen kompakttá. A 3D-szerkezet ismerete azonban még nem volt elegendô az SGCI-inhibitor mûködésének értelmezéséhez, ezért Orosz György közremûködésével az SGCI-peptid egyszerûsített modellezését vették tervbe. Ekkor kapcsolódtam be a kutatásba, és diplomamunkámat (1999), valamint doktori értekezésemet (2002) ebben a témakörben írtam. Célunk az volt, hogy – megtartva az SGCI esszenciálisnak vélt részeit – logikusan tervezett modelleket szintetizáljunk, megmérjük inhibíciós állandójukat, valamint NMR és molekuladinamikai technikát alkalmazva meghatározzuk térszerkezetüket és dinamikus tulajdonságaikat, amelyek összessége alapján részletekbe men?en következtetni lehet az inhibitor mûködésére. Három (17, 17, ill. 24 aminosavrészbôl álló) modellt terveztünk, szintetizáltunk és vizsgáltunk, összevetve eredményeinket az SGCI esetében kapottakkal. A harmadik modellpeptid inhibitor-hatékonysága – bár még nem érte el az SGCI-ét – de már összevethetô volt más analóg természetes inhibitorokéval. A szintézisre hatékony, konvergens peptidszintézist dolgoztunk ki. A kiindulási peptidfragmenseket o-klórtritil gyantán, ortogonális oldallánc-védelemmel szintetizáltuk. A lehasított, védett peptidszármazékokat oldatfázisban alakítottuk tovább, majd tisztítottuk. A peptidek analitikájához HPLC, aminosav-analízis, MS és NMR módszereket alkalmaztunk. A három modellpeptid és az SGCI összehasonlítása után arra a következtetésre jutottunk, hogy az inhibíciós hatásért elsôsorban a peptid aktív centrumának mozgékonysága a felelôs, azaz a merevebb kötôhurok jobb inhibitort eredményez. Felismerve, hogy a peptid mely szakaszai stabilizálják a köt?hurok szerkezetét, három újabb in silico modell tervezése útján, számítógépes molekuladinamikai szimuláció alkalmazásával kimutattuk, hogy ha a stabilizáló szakaszt béta-turnképzô szakasszal merevebbé tesszük, akkor valóban merevebb kötôhurkot kaphatunk, amely jobb inhibíciós tulajdonsággal rendelkezhet. Ezzel magasabb síkon visszajutottunk egy újabb laboratóriumi szintetikus és hatásvizsgálati feladat kijelöléséhez. A „merevebb kötôhurok – jobb inhibitor” elképzelést ab initio számolásokkal is alátámasztottuk, amelyek eredményei kiváló egyezésben vannak a kísérleti adatokkal. Az ab initio modellezés során az enzim inhibitor komplexének csupán 2%-át hagytuk meg; megtartottuk az enzim katalitikus triádját és néhány fontos szerkezeti elemét, és az inhibitor P1 és P1’ aminosavát. A reakció modellezése során a az elsô esetben szabad, a második esetben fix torziószögû P1–P1’ aminosavból álló inhibitor modellt alkalmaztunk. A két eset reakciógátjának különbsége 25 kJ/mol-nak adódott, ami egy 27550-szeres lassulást eredményez a fix torziószögû modell esetében a szabadhoz képest. Ez az érték jól egyezik a kísérleti adatokkal, ugyanis a mért adatok szerint egy inhibitor és egy szubsztrát sebességi állandójának hányadosa kb. 10000-tôl 50000-ig terjedô tartományba tehetô.
Bruckner-termi elõadások
Kémiai Osztály